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添加與不添加溶血加強液至含不同基礎培養基的Blood Agar Plate對 Staphylococcus aureus溶血能力的影響

2019.04.23

前言

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 及其腸毒素可經由食品媒介引起腸胃炎,為 食物中毒的主要致病原之一[1, 2]。中國大陸國 家標準金黃色葡萄球菌檢驗公告方法[3]建議 使用血瓊脂平板(BAP,以TSA或Columbia agar為基礎培養基)作為分離培養基。另外, 臨床微生物檢驗室常用TSA所配製的BAP接 種臨床檢體[4],以便初步識別不同溶血型式的分離菌。

此兩種檢驗室之所以使用BAP, 係因為可利用此菌在BAP的 溶血性( -hemolysis)作為生長菌落的識別[3, 4],BAP上菌落 的 溶血性係因為其中的紅血球被能夠產生溶 血素(hemolysin)的S. aureus所分解而破裂, 造成溶血現象,因此,菌落周圍將呈現環狀 透明[4]。 由於BAP配製所使用的基礎培養基因應 用對象不同而異,並且同種類菌不同菌株在 含有不同基礎培養基BAP的溶血能力是否相 同,將是臨床檢驗室或食品廠品管室檢驗人 員極欲了解的問題,目前,用於配製BAP的 基礎培養基種類包括 Tryptic Soy Agar-II

(TSA-II)、Columbia Agar、Brucella Agar以 及brain heart infusion agar (BHIA),配製後 倒平板前,再添加5~10%綿羊血。其中,含 TSA-II的BAP用於培養一般常見的細菌及酵 母菌,含Columbia Agar的BAP用於培養嗜 氧性與兼性厭氧菌以及絕對厭氧菌,含Brucella Agar之BAP用於分離厭氧菌,而BHIA 則常用於分離真菌[5]。 在檢驗室,不同鏈球菌常利用其生長菌 落在BAP呈現的溶血型做為菌種或不同血清 群的初步鑑定依據[6],一般 溶血型B群鏈球 菌(Group B streptococci,GBS)在 BAP的生 長菌落具有溶血性,但佔約3~5%的 溶血型 B 群鏈球菌卻無法在BAP呈現明顯溶血性[7, 8],因此,需要含有溶血加強劑才能誘導不 溶血的 GBS 菌落產生 溶血,否則易導致其 漏檢[9]。由於臨床上S. aureus亦可能出現侏 儒變異株(dwarf variant),其對營養需求較 高,在BAP上常形成微小的菌落,而且通常 不具 -溶血型[10, 11]。有鑑於此,本研究以添 加與不添加溶血加強液至含不同基礎培養基 (TSA-II、Columbia agar、Brucella agar 與 BHIA)之BAP探討是否會對S. aureus ATCC 25923與 ATCC 6538溶血能力產生影響。
材料與方法
菌株製備 本研究使用 S. aureus ATCC 25923與 ATCC 6538作為培養基生長效能測試的標準 菌株,菌株保存於-70℃,研究操作前,將上 述菌株移種至 BAP(啟新生物科技有限公 司,新北市),培養於35±1℃培養箱中18~24 小時,共接種兩次以活化菌株。之所以選擇 此兩種菌株做為研究對象,係因ATCC 25923 為臨床[4]以及中國大陸國標食品微生物學檢 驗:金黃色葡萄球菌檢驗建議的標準菌株[3], 而 ATCC 6538則為美國藥典[12, 13]及中華藥 典[14, 15]之無菌試驗法及非無菌產品中之特定微生物檢驗法建議的標準菌株。S. aureus ATCC 25923菌落在BAP上的菌落顏色為白 色,形狀為圓形、凸起典型菌落,而 ATCC 6538菌落顏色則為黃色,亦呈圓形、凸起, 兩種菌株的菌落大小相近。
培養基 本研究使用的各種基礎培養基均添加5% 綿羊血而製成 BAP,基礎培養基包含:(i) TSA-II、TSA-II+(TSA與 TSA-II+分別代表 未添加及添加溶血加強液之BAP);(ii) Columbia agar、Columbia agar+(Columbia agar、 Columbia agar+分別代表未添加及添加溶血 加強液之BAP);(iii) Brucella agar、Brucella agar+ (Brucella agar、Brucella agar+分別代 表未添加及添加溶血加強液之 BAP);(iv) BHIA、BHIA+(BHIA與 BHIA+代表未添加 及添加溶血加強液之BAP),這些含有各種 基礎培養基的BAP均購自啟新生物科技有限 公司(新北市,臺灣)。
測試菌懸浮液的製備 首先將新鮮生長S. aureus兩種菌株的生 長菌落分別以接種環挑取,然後移種至5 mL Tryptic Soy Broth (TSB)中,懸浮液調整至相 當於McFarland No. 0.5的標準濃度,並以分 光光度機測量調整其optic density (O.D.)值至 0.08~0.1之間,此時菌數約為1.5×108 CFU/ mL,接著進行十倍序列稀釋5次至約103 CFU/ mL後,然後進行各種BAP的溶血試驗。
溶血性試驗 以微量吸管分別吸取兩種菌株的菌液0.1 mL 單獨地加至 TSA-II、TSA-II+、Columbia agar、Columbia agar+、Brucella agar、Brucella agar+、BHIA 與 BHIA+ 所配製的 BAP,再以 無菌玻棒均勻塗抹,操作二重複。將所有接 種的BAP倒置培養於35±1℃培養箱,24±2小時後觀察所有BAP上生長菌落大小、溶血圈 大小,並進行菌落計數,然後比較未添加與 添加溶血加強液對兩菌株生長菌落溶血圈大 小的影響。以游標尺測量5 個單一菌落溶血 圈大小(cm)後加以平均,且計算標準差。本 研究以TSA-II血平板溶血圈大小作為對照組 (100%)比較兩種菌株在各種BAP的溶血能力。

結果
測試 S. aureus ATCC 25923與 ATCC 6538兩菌株在各個BAP (TSA-II、TSA-II+、 Columbia agar、Columbia agar+、Brucella agar、Brucella agar+、BHIA與 BHIA+)的菌 落數,選擇可計數的25~100 CFU 範圍,這 些BAP的平均菌落數落差都在30% 以內(圖 1),此指出兩菌株在各種 BAP 的生長效能 差別甚少[16],且各個BAP上生長菌落的大小 相近,並不受基礎培養基的成分差異與溶血 加強液添加與否的影響,但溶血圈大小卻受 到菌株種類與基礎培養基成分的影響。 ATCC 25923 在含 TSA-II,TSA-II+, Brucellla agar與 Brucella agar+ 的 BAP與對 照組TSA-II溶血圈大小相近,而Columbia+ 的溶血圈雖然大於Columbia者,但與對照組 TSA-II比較,還是較小。另外,結果指出此 菌株在BHIA+上生長菌落的溶血能力最差, 此指出加入溶血加強液,反而會抑制此測試 菌株的溶血能力。(表1) ATCC 6538在含Columbia+與 Brucellla agar的 BAP與對照組含TSA-II的 BAP上生 長菌落的溶血圈大小無太大差異,然而,在 含 BHI與 BHI+者比含TSA-II的 BAP對照組 減少約25%,且溶血圈被抑制更為明顯,尤 其是添加溶血加強液者更為顯著。(表1)
討論
S. aureus因含有溶血素( 、 、 、 毒 素)而可溶血紅血球,因此在BAP上的生長菌落具有完全( -)溶血性質,此特性可作為 初步鑑別此菌的依據之一[3, 4],因此,BAP 上生長菌落所顯現的溶血性直接影響檢驗人 員的判讀,由於S. aureus為臨床感染及食品 中毒常見的病原菌之一,因此,更需要依據 溶血圈作為初步鑑別。臺灣衛福部食藥署食 品金黃色葡萄球菌之檢驗,只建議使用BP培 養基(Baird-Parker medium)平板[17],而中國 大陸國標方法則建議使用BAP 與 BP平板作 為初步分離食品檢體中的S. aureus[3]。 本研究計算BAP上生長菌落溶血圈大小 時,皆選擇菌落數25~100 CFU/平板的單一 菌落作為量測目標,此係為了避免生長菌落 過多,溶血圈互相干擾而影響其等的量測。 從 BAP 的基礎培養基成分分析, TSA-II、 Columbia agar、Brucella agar都含有胰消化 蛋白腖(pancreatic digest of casein)作為氮素 源,氯化鈉作為細菌生長環境酸鹼變化的緩 衝劑,並維持滲透壓。其中,TSA-II額外添 加生長因子,Columbia agar添加牛浸心液與 玉米澱粉,而Brucella agar則含有亞硫酸氫 鈉[5]。S. aureus雖然可在含BHI成分的BAP 上生長,但其溶血能力不佳,研究結果發現 測試的兩種菌株在含BHIA與 BHIA+的 BAP 上溶血圈的大小都會下降,尤其是添加溶血 加強液者反而更會被抑制。另外,ATCC 6538 於添加溶血加強液之Columbia agar+ 上所出 現的溶血圈雖然比未添加者大些,但並不顯 著。 雖然S. aureus有些菌株生長菌落的外觀 屬於侏儒變異株(dwarf variants),通常菌落 微小,不產生溶血[9, 10],是否可藉由溶血加 強液的添加至BAP加以識別,值得未來加以 探討。 綜合上述,吾等認為(i) 含TSA-II、Columbia agar、Brucella agar基礎培養基的BAP 均可提供S. aureus生長菌落之明顯 -溶血性 而有助於其鑑別。(ii) 添加溶血加強液對 S.aureus 生長菌落之溶血圈大小與未添加者間 並無差異。(iii) 以 BHIA與 BHIA+基礎培養 基所配製的 BAP 不適用於 S. aureus 生長菌 落之鑑別,添加溶血加強液甚至會抑制此菌的溶血能力,因此,無論在食品或臨床檢驗 上,只需用以 TSA-II、Columbia agar、 Brucella agar基礎成分培養基配製的BAP進 行 S. aureus的分離及鑑別。




參考文獻
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